XVI amžiuje Kėdainiai augo sparčiai: 1520 metais mieste buvo 145 namai, gyveno apie 1 160 gyventojų, vyko turgūs ir buvo renkami turgaus mokesčiai.

1535 metais Kėdainiai tapo Žemaičių seniūnijos administracijos centru, mat miesto savininkas Jonas Radvila buvo paskirtas žemaičių seniūnu. Dvarą Jonas Radvila iš kairiosios miesto pusės, pavaldžios Trakų kunigaikštystei, perkėlė į dešiniąją pusę, pavaldžią Žemaičių seniūnijai, kadangi išdidūs žemaičiai tvarkyti krašto reikalų svetimoje teritorijoje nenorėjo. Naują dvarvietę Jonas Radvila įsteigė ant aukštos kalvos, prie Smilgos upelio. Mediniuose dvaro rūmuose vykdavo seniūnijos teismai, lankydavosi žemaičių valdininkai ir didikai, būdavo gabenamos duoklės.

1536 metais Kėdainiuose buvo 174 namai, gyveno apie 1 400 gyventojų.

1544 metų šaltiniuose Kėdainiai minimi „dideliu miestu prie dvaro“. Nuo 1549 metų jie tapo vienu pirmųjų reformacijos židinių Lietuvoje, nes tais metais miesto savininkė protestantė Ona Radvilaitė pakvietė į Kėdainius evangelikų kunigą ir leido jam pamokslauti Šv. Jurgio bažnyčioje. Nuo XVI a. II pusės iki XVIII a. I pusės Kėdainių savininkai buvo evangelikai reformatai, todėl ir miestas buvo protestantiškas.

1574 metais Kėdainiai vedybiniais ryšiais ir paveldėjimo teise perėjo Kiškų giminei ir jiems priklausė iki 1614 metų.

Kėdainių ekonomiką pagyvino 1568 metais Gardino seime suteikta teisė plėtoti prekybą Nevėžio upe, 1581 metais Varšuvos seime suteikta privilegija įsteigti uostą ir 1585 metais patvirtinti miesto amatininkų cechų nuostatai.

1590 metų balandžio 15 d Lenkijos karalius ir Lietuvos didysis kunigaikštis Zigmantas Vaza Kėdainiams suteikė Magdeburgo teises, kuriomis miestas gavo savivaldą. Kėdainių gyventojams leista rinkti magistratą, statyti rotušę, turėti pavyzdines svarstykles, ilgio ir saiko matus, rengti turgus ir tris metines muges. Su savivaldos teise valdovas patvirtino ir miesto herbą. Jame pavaizduota miesto savininkų Kiškų giminės simbolika: žydrame herbinio skydo lauke sidabrinė pasaga su trimis auksiniais kryžiais, o pasagos viduryje dvi į priešingas puses nukreiptos lašišos.